鲁米诺发光条件及合成方法研究报告

华东师范大学附属东昌中学

目 录

摘要

I. 引言

1.1鲁米诺的背景和用途

1.2研究的目的和意义

II. 鲁米诺发光条件的研究

2.1鲁米诺的发光机理

2.2影响鲁米诺发光的因素

2.3实验仪器及试剂

2.4实验过程和结果分析

III. 鲁米诺合成路径的研究

3.1实验仪器及试剂

3.2鲁米诺的合成方法

3.3实验过程和结果分析

IV. 结论

4.1总结研究结果

4.2对未来研究的展望和建议

V. 参考文献

摘 要

本文在高中实验室条件下初步探讨了鲁米诺荧光的机理、以铁氰化钾和铜氨络合物为催化剂的荧光效果、鲁米诺的全合成以及合成中试剂和条件的改良。在室温条件下，以铁氰化钾和铜氨络合物为催化剂均有较好的荧光表现，且铁氰化钾的催化性能明显优于铜氨络合物，并提出硝酸逐滴滴加、硫酸肼-乙酸钠-丙三醇混合液相体系和连二亚硫酸还原法三个主要改进方案。结果表明：改良后的鲁米诺合成方案产率为19.34%，明显优于传统方案。

I. 引 言

1.1 鲁米诺的背景和用途

鲁米诺是一种化学荧光分子，又名发光氨，学名为3-氨基邻苯二甲酰肼，于1853年首次合成，1928年化学发光特性被发现。在过氧化氢分子存在的条件下可以转变成激发态氨基邻苯二甲酸，后者发出较强的荧光。过氧化氢是许多生物氧化反应的产物，因此很容易通过引入鲁米诺将这些生物氧化反应与光检测联系起来。例如用葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶探头能够检测样品中的过氧化氢或葡萄糖的浓度，响应时间仅0.5s(动态法)。将化学发光物质与免疫学反应结合起来，用光反应表示被测的免疫成分浓度，称为化学发光免疫分析技术(chemiluminescence immune assay，CLIA)。1976年Shmeder提出了化学发光免疫分析，以鲁米诺-H202及衍生物ABEI为检测反应显示系统，目前鲁米诺（luminol）及其衍生物已经是化学发光免疫测定应用中最常用的标记物，它们在碱性条件下，通过微过氧化物酶（microperoxidase）催化，可释放出大量光子，鲁米诺可用于HRP标记抗体的Western Blot和HRP标记探针的核酸杂交检测，也用于现代刑侦血迹检测。由此看出，鲁米诺在精细合成分析、医学、免疫学等方面具有广泛的应用前景。

图一 产物鲁米诺的化学发光现象

1.2 研究的目的和意义

本文旨在以高中阶段所要求学生的化学素养为基础，对鲁米诺的发光条件和合成路径进行系统地研究和探讨，以期为相关领域的研究提供参考和借鉴，作为高中化学学科学生素养要求在化学理论基础和实验操作方面的一个拓展。具体而言，本文将首先介绍鲁米诺的基本特性和应用前景，然后重点介绍其发光机制和对鲁米诺荧光的主要液相环境及方法，以及主要鲁米诺的合成路径。最后对鲁米诺的发光条件和合成路径进行总结和展望。

II. 鲁米诺发光条件的研究

2.1 鲁米诺的发光机理

首先，H2O2在紫外光、部分金属离子等外部环境因素存在的情况下，分解出单线态氧(O2*)、·OH等。其中，H2O2的激发与Fenton试剂类似，生成氧自由基进攻鲁米诺分子，且O2*可与鲁米诺反应生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸，接着退激发态并发出明亮蓝光。

2.2 影响鲁米诺发光的因素

不同温度、溶液pH值、溶液各离子浓度以及催化剂的选择对鲁米诺的荧光强度和荧光时长都有影响.本文选取最常见的铁基催化剂-铁氰化钾以及铜基催化剂-四氨合铜离子分别探讨了鲁米诺的一般荧光条件，并且选取邻苯三酚-鲁米诺荧光体系使单线态氧能够荧光显色，从而间接证明其对鲁米诺的荧光激发作用。

为探究铁氰化钾和四氨合铜离子对鲁米诺发光性能的影响，我们进行了一系列实验。实验过程中，我们分别将铁氰化钾和四氨合铜离子加入鲁米诺溶液中，并通过荧光光谱仪和荧光显微镜对其发光性能进行了测试和分析。

2.3 实验仪器及试剂

2.4 实验过程和结果分析

2.4.1 以铁氰化钾作为催化剂

称取0.293克鲁米诺和1.012克氢氧化钠，加50毫升蒸馏水，加入30毫升30%过氧化氢，并加水至200毫升，配置成溶液A。称取0.15克铁氰化钾加入200毫升蒸馏水配置成溶液B。取A、B溶液各50毫升，混合，立即观察到明显的蓝色荧光，在较暗环境下观察到荧光平均持续4分39秒。

2.4.2 以铜氨络合物作为催化剂

称取0.293克鲁米诺和100毫升25%氨水，加入30毫升30%过氧化氢，并加水至200毫升，配置成溶液C。取50毫升溶液C，放入一小片铜片。观察到溶液从铜片表面开始发出蓝色荧光，并逐渐变强，在较暗环境下观察到荧光平均持续2分51秒。

2.4.3 实验结果分析

在室温条件下，以铁氰化钾和铜氨络合物为催化剂均有较好的荧光表现，且铁氰化钾的催化性能明显优于铜氨络合物。

III. 鲁米诺合成路径的研究

3.1 实验仪器及试剂

3.2 鲁米诺的合成方法

本文采用从由邻苯二甲酸脱水生成的邻苯二甲酸酐为起点，历经硝化、酰肼化和还原三个步骤，最后多次重结晶分离出较为纯净的样品，再经由2.4所介绍的荧光发生方法测定其有效荧光作用。

3.3 实验过程和结果分析

3.3.1 硝化

量取浓硫酸98%150毫升加入四颈烧瓶，另取浓硝酸68%125毫升加入分液漏斗中备用，称取已充分脱水的邻苯二甲酸酐76克加入上述烧瓶中。称取适量氢氧化钠配成尾气处理溶液并置于洗气瓶中。按图一所示组装仪器。在检漏、配置标口夹之后，将油浴锅设置恒温110度，打开磁搅，逐滴加入硝酸，反应1.5h至不再有气体生成。

图二 硝化邻苯二甲酸酐的反应仪器

反应结束后分离产物。先将所有产物转移至盛有1000毫升蒸馏水的烧瓶中缓慢溶解，烧瓶用冰蒸馏水洗涤并转移至烧杯。用玻璃棒蘸取反应液，浸润表面皿上的pH试纸，观察pH并用氢氧化钠调节pH至约为5，并放入冰箱0℃冷冻24h重结晶。（4号位上的硝基取代物在0℃时的水溶解度远高于3号位硝基取代物）将产品抽滤，并用冰乙醇洗涤2-3次。盛出剩余固体，边缓慢加入沸水边用磁搅搅拌至所有固体恰好溶解，再放入冰箱24h冷却结晶，随后抽滤，对滤液重复进行以上分离提取产物的操作2次，放入烘箱80℃烘干2h。得到23.71克3-硝基邻苯二甲酸，产率31.2%。

3.3.2 酰肼化

在烧杯中混合硫酸肼、无水乙酸钠、3-硝基邻苯二甲酸，加入80毫升丙三醇和少量蒸馏水，搅拌溶解。将反应体系加热至两百度，保持五分钟，当体系完全变为黄色油状液体，停止加热并冷却至100度，将体系转移至冰蒸馏水中（注：120度时有水蒸气和乙酸蒸汽，需要防护）将体系抽滤，用冰蒸馏水洗涤五次，洗去所有甘油。

3.3.3 还原

将上步中间产物转移至大烧杯防止反应时溢出，加入10%氢氧化钠溶液并置于集热式磁搅上直到固体完全溶解。逐次加入少量连二亚硫酸钠，反应生成硫酸钠和甲咪类，直到溶液由深红色（图二）褪至黄色（图三）时再少加入5克连二亚硫酸钠。结束后保持溶液沸腾5-10分钟。等溶液冷却至室温之后分多次滴加入0 °C左右的无水乙酸。将pH调至4-6后用冰的乙酸稀溶液洗涤并抽滤3次，烘干、研碎后得淡黄色固体产物（图四）。在无水或95酒精中重结晶，得最终产物 14.7克，产率 19.34%。

图三 还原3-硝基邻苯二甲酰肼（还原过程中）

图四 还原3-硝基邻苯二甲酰肼（还原结束时）

图五 重结晶前含杂质的 3-氨基邻苯二甲酰肼

3.3.4 结果分析

在3.3.1硝化过程中采取逐滴滴加硝酸的方式而没有采用传统工艺上的硝硫混酸是为了避免在加热硝化过程中硝酸发生分解导致底物未完全硝化从而造成的产率损失，实验结果表明，这一思路得到了很好地验证，较其他所给明的合成路径中三号位的硝化产物产率有了明显的提升。

在 3.3.2酰肼化过程中采取硫酸肼-乙酸钠-丙三醇反应体系取代传统工艺上的水合肼法一是为了溶解在水中难溶的三号位的硝化产物并作为液相反应的溶剂，二是丙三醇可以给肼提供更精准的进攻方向，三是边反应硫酸肼与乙酸钠边产生水合肼可以避免传统方法中水合肼挥发从而造成的产率损失和环境污染，四是反应物低毒且更加经济。

在 3.3.3 还原过程中采取连二亚硫酸钠代替传统工艺中稀盐酸-铁粉，还原效率更高，可观地提高了产率。横向对比氯化亚锡还原的方案更加经济而且避免在碱性条件下产生难以分离的沉淀。

在实验过程中，需要注意可能由于硝化过程中凡士林碳化、反应液过热，还原过程中应当分批且少量地加入连二亚硫酸钠防止反应液随气泡溢出等原因导致产率下降。

IV. 结 论

4.1 总结研究结果

本课题初步探讨了鲁米诺荧光的机理、以铁氰化钾和铜氨络合物为催化剂的荧光效果、鲁米诺的全合成以及合成中试剂和条件的改良。

其中，我们发现铁氰化钾作为催化剂有明显的优势，并提出硝酸逐滴滴加、硫酸肼-乙酸钠-丙三醇混合液相体系和连二亚硫酸还原法三个主要改进方案。

4.2 对未来研究的展望和建议

随着医药、荧光示踪、流动液相分析、精细化学合成和军用等领域对高效冷光源的需求在不断提升，例如荧光检测新冠病毒，对新型的化学荧光药品的研究也呼之欲出。笔者将目光投向N，N-二烷基异鲁米诺这一系列的鲁米诺衍生物，提出了一种新型的合成N，N-二丁基异鲁米诺的路径。相较于以 ILITC、ABEI、DPEH 等为代表的新型类鲁米诺化学发光试剂，N，N-二烷基异鲁米诺发光强度平均为鲁米诺的3-5倍，具有用量小、发光效率高和发光时间长等优良性能，在新型化学发光试剂领域有很大的应用前景。

图六 以DBP为起点 N, N-二丁基异鲁米诺的合成路径

V. 参考文献

[1] 匡永清,孙晓莉,何炜,尉琳琳. 6-[N-(氨基丁基)-N-乙基]氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮的合成[J]. 第四军医大学学报,2002,23(11):1037-1039.

[2] 徐红. Luminol-DMSO-NaOH流动注射化学发光体系研究[J]. 信阳师范学院学报(自然科学版),2007年1月第20卷第1期:78-82.

[3] 刘向阳.N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺／CoFe204纳米粒子／石墨烯复合材料的合成、化学发光和磁性研究[D],2017年5月.

[4] 伍斌,沈娟,曹敏,等.N,N-二丙基异鲁米诺的合成及其光谱性质[J].化学与生物工程,2017,34(2):42—44.

[5] 伍斌.吖啶橙和异鲁米诺衍生物的合成与光谱性质[D],2017年5月.

[6] 吴世康.具有荧光发射能力有机化合物的光物理和光化学问题研究[J],化学进展,2005年1月,第17卷第l期:15-39.

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